ISOLASI BAKTERI

Dialam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologinya, sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Dalam mempelajari mikroba tidak biasa dilakukan secara kasat mata. Sedangkan dalam suatu lokasi yang menurut manusia sudah cukup kecil, disanan masih terdapat bakteri dalam jumlah besar dan juga bermacam–macam jenisnya. Selain itu, di alam mikrobia pada umumnya tidak hidup tersendiri sebagai individu tunggal dan terlepas dari spesies yang lain, Mikroba lebih sering ditemukan dalam bentuk koloni dan bersama-sama dengan mikroba yang lain (Sailer,2000).

Mikroorganisme terdapat dimana-mana didalam lingkungan kita mereka ada pada tubuh kita, didalam tubuh kita, dan disekeliling kita. Mereka merupakan komponen penting dalam ekosistem. Dihabitat alamiahnya, mereka hidup dalam suatu komunitas yang terdiri dari berbagai jenis mokroorganisme, bersama spesies-spesies biologi lainnya. Didalam komunitas ini, satu spesies mikroba dapat mempengaruhi spesies lain dengan  berbagai cara-cara beberapa bersifat menguntungkan beberapa merugikan ( Pelezar, 1988 ).

Oeh karena itu, dalam mempelajarinya, bakteri harus diambil dari alam lalu diisolasikan dalam suatu biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang hanya berisi 1 jenis bakteri (Pelczer et al.,1988).

mempelajari suatu jenis mikroorganisme dalam laboratorium, mikroorganisme yang bersangkutan perlu dipisahkan (diisolasi) dari keberadaannya dengan mikroorganisme lain di alam. Kegiatan isolasi biasanya diikuti dengan kegiatan pemurnian dan perbanyakan. Mikroorganisme yang bersifat saprofit benar, saprofit fakultatif, dan parasit fakultatif dapat diisolasi dengan kultivasi pada medium kultur buatan. Pada mikroorganisme parasit obligat, medium kultur yang digunakan berupa sel hidup, jaringan hidup atau organism inangnya.

Salah satu factor yang perlu diperhatikan dalam kultivasi mikroorganisme adalah factor kebutuhan nutrient, disamping factor-faktor lain yang diperlukan untuk kehidu,pannya. Cara isolasi dan kultivasi mikroorganisme yang satu dengan lainnya terkadang sangat berbeda dan mengikuti cara-cara tertentu agar mikroorganisme yang diisolasi memang benar-benar terpisah dari keberadaannya dengan mikroorganisme lain dan pertumbuhannya seperti yang diharapkan.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam isolasi dan kultivasi yaitu sebagai berikut :

1.      Semua peralatan dan sarana dalam keadaan steril (bebas mikroorganisme hidup) atau bebeas kontaminan (mikrooganisme yang tidak dikehendaki).

2.      Dilakukan secara aseptic (tidak memberikesempatan untuk terjadinya kontaminasi), misalnya :

a.       Dilakukan didalam ruangan yang steril.

b.      Pembukaan medium kultur seminimum mungkin.

c.       Arah pembukaan medium tidak berlawanan dengan arah sirkulasi udara/angin.

d.      Setiap langkah selalu memperhatikan tingkat sterilitasnya.

Salah satu tindakan isolasi bakteri dapat dilakukan dengan metode gores. Penggoresnya berupa jarum ose yang ujungnya membawa isolat bakteri. Goresan harus dibuat sedemikian rupa sehingga medium kultur tidak tergores dan bagian tersentuh dari goresan menimbulkan koloni bakteri yang benar-benar terpisah antar koloni satu dengan lainnya. Arah goresan dapat merupakan pembagian sektoral atau horizontal.

Metode kultivasi untuk isolasi bakteri yang paling popular adalah metode bentang rata (spreadplate method) dan metode tuang rata (pour-plate method). Perbedaan utama dari kedua metode ini yaitu bahwa metode bentang mengkultivasi sampel merata pada permukaan medium padat, sedangkan metode tuang mengkultivasi sampel merata ke seluruh medium. Metode bentang akan menuangkan medium lebih dahulu kemudian setelah medium memadat ditetesi suspense sampel (biasanya tidak lebih dari 0,1 mL) dan diratakan pada permukaan medium menggunakan batang gelas steril bentuk huruf L.

Metode tuang akan menaruh sampel (biasanya 0,1 mL suspense atau 0,1 g padatan) lebih dahulu kemudian dituangi medium yang sedang mencair. Hasil kultivasi dari kedua metode tersebut biasanya juga berbeda. Metode bentang akan tumbuh koloni di permukaan medium saja, sedangkan metode tuang akan tumbuh koloni baik di permukaan maupun di bawah permukaan medium.

Dari hasil isolasi dan kultivasi akan dihasilkan biakan koloni. Biakan merupakan kumpulan mikroorganisme yang tumbuh pada medium kultur, sedangkan koloni merupakan kumpulan mikroorganisme sejenis hasil reproduksi yang mengumpul pada satu tempat di medium kultur atau kumpulan mikroorganisme pada medium kultur yang berasal dari hasil pertumbuhan atau keturunan dari satu individu mikroorganisme.

Mikroorganisme sebagai makhluk hidup sama dengan organisme hidup lainnya sangat memerlukan energi dan bahan-bahan untuk membangun tubuhnya, seperti dalam sintesis protoplasma dan bagian-bagian sel lainnya. Bahan-bahan tersebut disebut nutrien. Untuk memanfaatkan bahan-bahan tersebut, maka sel melakukan suatu kegiatan-kegiatan, sehingga menyebabkan perubahan kimia di dalam selnya. Semua reaksi yang teratah yang berlangsung di dalam sel ini disebut metabolisme. Metabolisme yang melibatkan berbagai macam reaksi di dalam sel tersebut, hanya dapat berlangsung atas bantuan dari suatu senyawa organik yang disebut juga biokatalisator yang dinamakan enzim (Djide, 2006).

Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. “Selain itu, secara umum nutrient dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk sintesis biologik oranisme baru (Jawetz, 2001).

Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai penghitungaan bakteri yang dikenal dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah sekali dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan indikator (Achmad, 2007).

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain : harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik    (Sutedjo, 1990).

Suatu medium yang mengandung substansi kompleks seperti ekstrak daging sapi, ekstrak khamir, tripton, dan darah disebut sebagai medium buatan atau medium kompleks (artificial or complex medium). Sebagai lawannya, kita acu medium yang rumus kimia masing-masing ramuannya dapat dituliskan sebagai medium sintesis (synthtetical medium) atau medium yang ditentukan (difined medium). Medium sintesis mungkin sangat rumit dan sangat berbeda sesuai dengan organisme tertentu yang hendak ditumbuhkan. Untuk sebagian besar, medium sintesis hanya digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di laboratorium penelitian (Volk & Wheeler, 1993).

Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi padat. Namun, yang paling umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama agar-agar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat yang diekstraksi dari alga marin genus gelidium, namun sebagian mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993).

Untuk perhitungan mikroorganisme mungkin yang paling sering digunakan adalah prosedur penumbuhan dalam agar. Secara sederhana suatu contoh suspensi sel atau bahan pangan homogenat diinokulasi ke dalam atau ke atas media nutrien agar dan setelah diinkubasi, jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Karena satu koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutan asalnya (Buckle, 1985).

Ada berbagai cara untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni yaitu, cara pengenceran, cara penuanagan, cara penggesekan, atau penggoresan, cara penyebaran, cara pengucilan 1 sel, dan cara inokulasi pada hewan. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangan. (Waluyi,2007).

Untuk metode streak plate misalnya, mikroba diletakan didalam pada ujung palte mengguanakan ose, lalu digoreskan pada permukaan medium agar tersebut dengan pola tertentu yang khas. Ada pula metode Pour Plate atau penuanga. Metode ini dapat digunakan untuk penghitungan bakteri secara langsung. Karena sebelum dituang bakteri tersebut diencerkan terlebih dahulu. Sehingga syarat penghitungan langsung yaitu dalam 1 media terdapat 30-300 koloni dapat terpenuhi(Prescott et.al.2008).

Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatan bersama-sama bakteri saproba. Yang terakhir ini boleh disebut penyerbu yang membonceng (secondary invaders). Mungkin juga bakteri patogen yang membonceng. Untuk menentukan siapa pembonceng dan siapa yang diboncengi diberikan pedoman “siapa yang kedapatan di situ lebih dulu, dan siapa yang datang terkemudian”.

Untuk menyendirikan suatu spesies ada dikenal beberapa cara, yaitu:

1.          Dengan pengenceran

Cara ini pertama-tama dilakukan oleh Lister dalam tahun 1865. Ia berhasil memiara murni Streptococcus lactis yang diisolasikannya dari susu yang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Dan dari pengenceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies ini dapat kita jadikan biakan murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.

2.             Denagn penuangan

Robert Koch (1843 – 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian yang diperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti tersebut di atas ini, maka akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin. Dalam melakukan metode ini ada dua orang pembantu Koch yang sangat berjasa, yaitu Petri yang menciptakan cawan dengan tutup yang sekarang terkenal sebagai cawan Petri (Petri dish). Pembantu yang kedua ialah Hese yang menemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin. Memang agar-agar ternyata lebih baik daripada gelatin untuk bahan pengental suatu medium. Agar-agar tidak lekas mencair, titik cairnya 95o C.

3.          Denagan pengesekan

Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, tapi dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Jika ujung kawat inokulasi dibengkokkan, kemudian ujung itu setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian daripada itu (kurang lebih setelah 12 jam) akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebat di permukaan medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu biakan murni.

4.          Denagan mengucilakan satu sel

Kita mempunyai alat yang dapat mengambil satu bakteri dari sekian banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Alat semacam itu disebut mikropipet. Alat itu ditempatkan pada tangan-tangan suatu mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakukan di bawah obyektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke suatu medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berbiak dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh biakan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran, lagi pula, mikromanipulator itu sangat mahal.

5.         Denagn inokulasi hewan

Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari seseorang yang sedang menderita tbc. Jika dahak itu disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, maka bakteri-bakteri saproba yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita peroleh semata-mata basil tbc saja. Biakan Pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati itu akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai. Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit (intracutaneous), dapat di bawah kulit (subcutaneous), dapat di dalam otot (intramuscular), dapat di dalam rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi.

Perhitungan secara penumbuhan dalam cawan petri dapat dilakukan dengan menggunakan tiga metode yaitu : dalam metode penuangan, 1,0 ml contoh dipindahkan ke dasar cawan dan dituangkan diatasnya 15-20 ml media agar yang telah didinginkan sampai 45^o – 50^oC dan dicampur serata mungkin. Setelah inkubasi, koloni baik yang tumbuh di dalam agar atau dipermukaannya dihitung. Prosedur ini termasuk yang paling peka, sampai sejumlah 20 sel/ml dapat dihitung. Metode ini tidak dapat diterapkan dalam studi lapangan karena dibutuhkan alat-alat untuk mencairkan dan mendinginkan media agar. Berikutnya metode penyebaran pada permukaan cawan dilakukan dengan menggunakan 0,1 ml larutan contoh disebaratakan di permukaan media agar yang tersedia dengan tongkat gelas yang melengkung (bent glass rod) yang telah disterilkan. Setelah inkubasi, koloni yang tumbuh di permukaan dari media dihitung. Karena penggunaan volume larutan yang sedikit yaitu 0,1 ml, maka kepekaannya sekitar 300 sel/ml. Oleh karena media agar dalam cawan telah disiapkan lebih dahulu, maka metode ini dapat diterapkan dalam studi lapangan. Dan terakhir adalah metode penetesan pada cawan, media yang dipersiapkan terlebih dahulu dibagi-bagi menjadi 3 atau 4 sektor dan setetes larutan contoh (0,02 ml) dipindahkan ke masing-masing sektor. Setelah tetesan tersebut dibiarkan kering, cawan petri kemudian diinkubasi. Suatu pipet penetes yang telah dikalibrasi dipergunakan untuk mengukur dan memindahkan tetesan. Pengenceran contoh diatur sedemikian rupa sehingga diperoleh antara 5 sampai 20 koloni terbentuk dari setiap tetesan pada permukaan media agar. Satu keuntungan metode ini adalah bahwa perhitungan dapat dilakukan 3-4 kali ulangan sekaligus dalam satu cawan, sehingga dapat menghemat bahan-bahan untuk uji mikrobiologi. Contoh bahan yang mengandung sekecil 250 sel setiap ml masih dapat dihitung dan teknik ini dapat diterapkan dalam percobaan-percobaan lapangan (Buckle, 1985).